淺談臨床級干細胞庫的建設(shè)與管理

建設(shè)臨床級干細胞庫是搶占優(yōu)質(zhì)資源戰(zhàn)略高地的核心，本文依據(jù)干細胞研究相關(guān)國內(nèi)外規(guī)范，闡述臨床級干細胞庫的建設(shè)與管理，以期為建庫機構(gòu)提供有益借鑒。

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臨床級干細胞庫的規(guī)劃

迄今為止，我國尚未出臺臨床級干細胞庫區(qū)域化集中設(shè)置規(guī)范，干細胞在不同培養(yǎng)條件下（如試劑、工藝、凍存方法等），即使是同樣的細胞系，表型也可能不一致。同一機構(gòu)內(nèi)不同研究方向的干細胞出處也不盡相同，相互間的研究結(jié)果并無可比性。據(jù)全球科學界評估，細胞系鑒定錯誤或污染達18%～36%，質(zhì)量控制檢測公司報告的支原體感染率大約占總測試樣本的8%，故合理規(guī)劃臨床級干細胞庫，采用統(tǒng)一的方法與質(zhì)量標準進行采集、集中制備、存儲與分發(fā)，將潛在風險及外來因子的污染降到最低具有明顯優(yōu)勢。

臨床級干細胞庫建設(shè)應遵循法律法規(guī)及國際干細胞研究協(xié)會相關(guān)倫理原則，樣本采集與干細胞存儲須遵守《人類遺傳資源管理暫行辦法》，在人類遺傳資源辦批準的范圍內(nèi)開展工作。利用干細胞庫資源開展臨床研究必須遵循科學與倫理，保護受試者權(quán)益，符合《藥物臨床試驗質(zhì)量管理規(guī)范》、《干細胞臨床試驗研究管理辦法（試行）》和《干細胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導原則（試行）》。

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臨床級干細胞庫的建設(shè)與要求

一、如何選址

臨床級干細胞庫應選擇安全、無干擾的獨立與封閉區(qū)域，遠離嚴重污染(空氣、水、病原微生物、放射性同位素等)，遠離振動/噪聲，盡可能毗鄰樣本采集與臨床治療點，減少樣本的轉(zhuǎn)運時間，便于及時處理與制備，實現(xiàn)流程無縫對接。存儲區(qū)優(yōu)先選擇地面以上較低樓層，避免雨水/洪水倒灌，防霉防潮，保持良好的溫濕度。

二、功能區(qū)規(guī)劃與管理

（一） 核心功能區(qū)與輔助區(qū)

核心功能區(qū)，涵蓋樣本與細胞收發(fā)室、制備與處理室、存儲區(qū)、質(zhì)檢室與總控室，必要時設(shè)置接待征詢室和采集室。細胞制備的潔凈區(qū)域應具備緩沖區(qū)、更衣室，滿足細胞的分離、擴增與培養(yǎng)，各制備套間周圍設(shè)置潔凈的走廓，增加流程的靈活性。細胞制備操作區(qū)應設(shè)立潔凈區(qū)，根據(jù)《GB50073潔凈廠房設(shè)計規(guī)范》，潔凈區(qū)面積規(guī)劃一般為2～4m2/人，潔凈區(qū)滿足GMP要求，其設(shè)計、建設(shè)、管理、進出、使用、清潔、消毒、環(huán)境檢測等參見《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》無菌藥品附錄[13],干細胞制劑的生產(chǎn)必須在B級背景下的A級潔凈區(qū)完成。根據(jù)功能需求杜絕污染，必要時設(shè)置隔離區(qū)，避免隔離區(qū)的空氣進入其他區(qū)域；為減少不同批次細胞在研究中的變異性，在制備階段應對同一批特定代次的細胞建立多級細胞庫區(qū)，庫區(qū)應防止混淆、差錯和交叉污染。輔助功能區(qū)包括辦公室、會議室，檔案室，庫房及洗消室等。

（二）流程與流向

布局的流程與流向應合理有序并明確標識，設(shè)置人員、物料、細胞、污物流向與醫(yī)療廢棄物專用通道，確保生物安全，減少污染風險，為了便于樣本、試劑、物料與細胞制劑按規(guī)定的流程和流向傳遞，可在入口與出口處合理設(shè)置傳遞窗，提高工作效率。

三、 人員配備

應建立與業(yè)務相適應的組織架構(gòu)，明確管理路徑、職責、權(quán)限及相互關(guān)系，配備相應資質(zhì)(職稱、學歷、培訓和實踐經(jīng)驗)的操作人員和管理人員。對人員培訓、考核并評估效果，采集人員需經(jīng)培訓合格并持有醫(yī)師或護士執(zhí)業(yè)證書，采集信息雙人復核；制備人員應進行無菌服穿戴的培訓；制備、質(zhì)量管理負責人與質(zhì)量受權(quán)人不得相互兼任；如個別崗位職責需委托他人，受委托人應同樣滿足該崗位職責的資質(zhì)要求，委托人仍然承擔最終責任。

四、設(shè)施與設(shè)備

應為所有設(shè)施設(shè)備設(shè)計充足合理的空間，根據(jù)各區(qū)域面積及功能規(guī)劃供暖、通風(自然/壓力)、空調(diào)、水電、照明、滅菌、監(jiān)控、溫濕度、氧濃度、消防、污水與醫(yī)療廢棄物處理系統(tǒng)等，并定期清潔、維保、校準和質(zhì)檢，制定應急預案。應監(jiān)測生物安全柜、潔凈室的顆粒及生物負載系統(tǒng)，包括高效微?？諝膺^濾系統(tǒng)、A/B潔凈室內(nèi)的空調(diào)凈化系統(tǒng)；應規(guī)定監(jiān)測頻率和監(jiān)測項目，如靜態(tài)和動態(tài)下的懸浮粒子、沉降菌、浮游菌、表面微生物、壓差、風速、溫濕度等；對于B級背景下的A級區(qū)應采用在線塵埃粒子監(jiān)測系統(tǒng)懸浮粒子；定期清洗和更換初、中效過濾器，并定期在工作狀態(tài)下對高效過濾器進行檢漏，以防止損傷和泄漏。

存儲庫區(qū)應充分考慮樓面承重，設(shè)施設(shè)備規(guī)劃與安全管理遵循《ISBER最佳實踐2018》[14]，如配備雙路供電或應急發(fā)電設(shè)施及備用存儲空間、冷鏈監(jiān)控等；縮短液氮塔到庫區(qū)的距離，減少氮氣的耗損；液氮與干冰區(qū)域應配備氣體監(jiān)測器、聲光報警和排風系統(tǒng)，一旦房間內(nèi)氧濃度低于設(shè)定的下限時自動啟動強排風，液氮區(qū)地面杜絕使用磁磚，優(yōu)選耐低溫的環(huán)氧樹脂，冰箱區(qū)應充分考慮散熱，必要時安裝專用散熱通道；操作人員應配備厚型隔熱手套、護目鏡/面具以及防護外套以確保安全。

干細胞制劑的存儲須杜絕交叉污染，設(shè)置合格、待檢與不合格區(qū)且標識明顯；集約設(shè)計監(jiān)控裝置，實現(xiàn)24 h溫度連續(xù)監(jiān)控及遠程報警，確保液體供氣系統(tǒng)不間斷供氣及外置塔的安全運轉(zhuǎn)(儲存、調(diào)壓、氣化等)，設(shè)置保護圍欄和安全警示標識并定期安全檢查，校驗供氣管道與遠程液位監(jiān)控系統(tǒng)，對于液氮補給罐或液氮輸送系統(tǒng)所有閥門、壓力表與安全閥應定期檢查(年檢或強檢)，確保系統(tǒng)連續(xù)平穩(wěn)、安全節(jié)氣，液氮設(shè)備的運行與維修人員應具備《特種行業(yè)資格證》，可外包給專業(yè)公司進行檢修。

所有設(shè)備應建檔受控，專人管理且標識唯一，分光光度計、移液器、天平、離心機等需定期進行計量檢定與校準。實驗室必備的安全設(shè)施(通風櫥、防塵罩、滅火器、洗眼噴淋裝置等)應定期進行檢查。

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采集、制備與檢驗

采集前，需對供者進行入組篩查和傳染病因子檢測，包括人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類嗜T細胞病毒、EB病毒、巨細胞病毒、梅毒螺旋體等；篩查合格的供者簽署知情同意書后，遵循標準操作規(guī)程采集樣本，將污染、感染和病原體傳播的風險降到最低。

臨床級干細胞的制備應嚴謹、審慎并進行獨立審查和監(jiān)督，確保其安全性和有效性。即使對細胞進行最小的體外操作都有可能引入額外風險，如病原體污染、培養(yǎng)代數(shù)增加導致的細胞基因型和表型不穩(wěn)定，在長期、壓力環(huán)境下可能會變?yōu)榉钦扼w或發(fā)生DNA重組、缺失及其他基因或表觀遺傳異常，從而帶來嚴重病理改變，如癌癥。故臨床級干細胞的制備應遵循GMP程序，防止原料和產(chǎn)品在生產(chǎn)過程中被污染，所有試劑與制備過程均應遵守質(zhì)量控制體系與規(guī)程，確保試劑質(zhì)量、制備工藝與制定的方案保持一致，形成細胞鑒定、純度和潛能分析標準，而對于傳染病因子陽性的干細胞制備需在獨立設(shè)置的陽性間進行。

過程中的關(guān)鍵性物料必須做到：

先驗證性能，確保有效性且符合相關(guān)規(guī)定；

直接與原始樣本及干細胞制劑接觸的物料必須無菌且對人體無害并符合要求的級別，盡可能使用藥用級別的物料；

非無菌物料和非一次性物料必須清潔和滅菌，滅菌合格并被監(jiān)控；

記錄使用的關(guān)鍵物料，確?？赏暾麥蚀_地追蹤到每個環(huán)節(jié)中物料的詳細信息，包括使用的試劑/耗材/設(shè)備清單、生產(chǎn)廠家、批次號、合格證等，關(guān)鍵試劑如血清、酶和生長因子的分析證書(certificate of analysis，COA)副本，測試過程和結(jié)果等。

在細胞培養(yǎng)或保存時除了盡可能避免使用抗生素外，還應避免使用動物源性或成分不明確的試劑、人源或動物源性血清，動物源性成份應盡可能用規(guī)定的化學成份替代，禁止使用同種異體人血清或血漿，以確保干細胞制劑的質(zhì)量。

臨床級干細胞制劑的檢驗分為全面質(zhì)量檢驗、復核檢驗和放行檢驗，為確保干細胞治療的安全性和有效性，每批干細胞制劑均須符合現(xiàn)有干細胞知識和技術(shù)條件下的全面質(zhì)量要求,參見《干細胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導原則(試行)》。

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標識、存儲和發(fā)放

一、 標識

每份干細胞制劑應分配唯一的編碼，編碼規(guī)則應具唯一性和統(tǒng)一性，通過編碼可追溯到捐贈者和制劑存放位置及處理等所有信息，標簽應耐低溫耐潮濕。可以使用國際血庫自動化推薦的ISBT128碼。隨著自動化設(shè)備的使用，容器自帶編碼(如激光蝕刻)、無線射頻識別電子標簽等的出現(xiàn)，人為編碼打印和手工粘貼標簽將逐步被新模式所取代。

二、 存儲

（一）冷凍保存

冷凍保存過程中應避免冰晶與溶質(zhì)損傷?？墒褂贸绦蚪禍貎x或其他替代方法(如Nalgene程序降溫盒)控制降溫速度，并使用二甲基亞砜或甘油冷凍保護劑。為防止不可抗性因素所導致的損壞或丟失，需將同一來源的細胞分成若干份，分放不同區(qū)域的不同容器中長期保存即鏡像保存(mirror image storage)。對于干細胞的長期存儲，國際公認使用氣相液氮罐較理想，保存的溫度為-150 ℃～-196 ℃，需關(guān)注干細胞穩(wěn)定儲存的時間以及如何在儲存中防止污染等。隨著自動化液氮存儲設(shè)備的出現(xiàn)和發(fā)展，干細胞存取將走向自動化和智能化。

（二）容器

避免因容器滲漏而導致的交叉污染。容器應明確標識，且具有無菌、化學耐受、無吸附(對細胞、蛋白、RNA和 DNA)、無酶、密封(帶螺紋)、耐低溫等特性，限一次性使用，不含有干擾物質(zhì)。臨床級干細胞容器的無菌保證水平要求為10*-6(99.999 999%)，即一百萬件產(chǎn)品中可能存在活微生物的概率為1。應使用能足夠防漏、抗振、抗壓力、抗溫度變化、防刺穿和其他事故材料制成的外容器運輸干細胞，一般使用干式液氮罐作為外容器進行轉(zhuǎn)運。

三、 審核、放行與分發(fā)

干細胞在分發(fā)前必須進行審核與放行控制，審核與放行的程序和記錄既是質(zhì)量保證/質(zhì)量控制架構(gòu)的縮影，也是制備過程中產(chǎn)生的科學數(shù)據(jù)的存儲。審核與放行通過取走最終樣本進行測試、成品細胞標識和運輸，證明干細胞從正式進入實驗室系統(tǒng)到實現(xiàn)預期功能的整個過程。

干細胞的放行處理是通過選擇實用、快速、科學可控的放行檢驗獲得COA或放行檢測報告后實施的。COA總結(jié)了產(chǎn)品的特性、所進行的測試、分發(fā)時能否提供結(jié)果并詳細介紹放行的標準和每一個測試結(jié)果、測試使用方法、敏感度或可接受的結(jié)果范圍。測試結(jié)果的放行標準一般來自法規(guī)、臨床研究申請及文獻。證書必須經(jīng)檢測者、檢測負責人和質(zhì)量授權(quán)人審核并簽署，隨細胞一起發(fā)布。因此，應建立放行后測試結(jié)果和所有記錄的相關(guān)審核程序，以及放行后測試結(jié)果不符合規(guī)定要求的應對機制。

臨床級干細胞庫應規(guī)定保存條件、周期及銷毀的規(guī)范，避免混淆、污染、交叉污染和不合理的分發(fā)。發(fā)放的細胞治療產(chǎn)品應明確給出新鮮和冷藏后復蘇產(chǎn)品的失效日期和時間。分發(fā)后干細胞制劑的運輸和轉(zhuǎn)送程序要確保其完整性及人員的健康和衛(wèi)生，需經(jīng)過驗證在維持細胞活力和功能完整性的情況下運輸或轉(zhuǎn)運到輸注現(xiàn)場，干細胞的轉(zhuǎn)運應由訓練有素的物流人員或商業(yè)運輸公司監(jiān)管，應有證據(jù)表明在運輸中保持合適的溫度。溫度記錄儀的使用現(xiàn)在最為廣泛，運輸過程中的溫度應符合收集機構(gòu)標準操作規(guī)程手冊的要求。

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信息管理系統(tǒng)

臨床級干細胞庫信息管理系統(tǒng)的構(gòu)建需根據(jù)其用途和功能來構(gòu)建，著眼于干細胞全生命周期的數(shù)據(jù)跟蹤，實現(xiàn)雙向性追溯，應從干細胞臨床研究全過程進行布局，實現(xiàn)從臨床中來到臨床中去的閉環(huán)管理。

若要滿足多中心研究，全局數(shù)據(jù)庫需與各站點系統(tǒng)進行端口對接。這方面可借鑒阿斯利康(Astra Zeneca，AZ)用于藥物研究的細胞庫信息系統(tǒng)建設(shè)經(jīng)驗，AZ位于英國阿爾德利研發(fā)基地的Global Cell Bank是集中化、全方位負責細胞庫，從獲取多種來源的細胞系開始，到產(chǎn)生供使用的一系列細胞庫，對所有單元庫執(zhí)行嚴格的質(zhì)量控制測試，除了每個站點的中央存儲庫外，單個全局數(shù)據(jù)庫保存所有相關(guān)的單元數(shù)據(jù)，允許用戶查找和申請細胞，將細胞分發(fā)給世界各地站點(如瑞典蒙道爾、美國波士頓、中國上海等分庫)。

臨床級干細胞庫信息管理所包括的數(shù)據(jù)范圍廣泛，涵蓋：

臨床模塊，遵從《藥物臨床試驗質(zhì)量管理規(guī)范》。主要實現(xiàn)了臨床前、中、后干細胞供者與受試者的相關(guān)信息管理，如臨床研究立項、科學與倫理審核、知情同意、供者與受試者的人口統(tǒng)計學信息、入組標準、篩選信息、臨床中的應用劑量、輸注方式、應用后的檢測數(shù)據(jù)與隨訪信息等；

制備與質(zhì)檢模塊。包括樣本的清點接收、干細胞的分離、純化、擴增、培養(yǎng)、冷凍、復蘇、轉(zhuǎn)運、質(zhì)量檢測等信息管理，如制備、質(zhì)檢方案、方法學及其驗證信息、細胞生長條件和培養(yǎng)基、過程中相關(guān)的質(zhì)量檢測與數(shù)據(jù)控制等；

存儲庫模塊。實現(xiàn)了原始樣本與干細胞制劑及其衍生物等的信息管理，同時此模塊實現(xiàn)了樣本源(供者/受試者)信息、干細胞制劑信息與臨床信息的關(guān)聯(lián)，通過組合查詢可快速檢索到目標樣本與制劑，包括細胞名稱、細胞類型、來源、編碼(二維碼)，信息系統(tǒng)可追蹤監(jiān)控凍存細胞位置、庫存水平、使用情況和質(zhì)量控制數(shù)據(jù)生成等。例如，同濟大學附屬東方醫(yī)院采用Browser/Server模式和模塊化設(shè)計，各模塊通過端口對接實現(xiàn)干細胞臨床研究全過程的數(shù)據(jù)跟蹤和追溯性管理，構(gòu)建了符合管理路徑和工作流程的干細胞臨床研究信息管理系統(tǒng)，可追蹤供者、受試者、關(guān)鍵物料、關(guān)鍵設(shè)備、操作流程、細胞、樣本或服務歷史、應用情況或所處位置等信息；同時構(gòu)建了臨床科研數(shù)據(jù)中心模塊，可連接上述三大模塊，與醫(yī)院信息系統(tǒng)、病理信息系統(tǒng)、影像歸檔和通信系統(tǒng)等端口對接并實施管理，能夠獲取患者信息并建立備份模板，具有高級搜索、篩選和組合查詢功能。

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全面質(zhì)量管理體系

干細胞臨床研究的醫(yī)療機構(gòu)是干細胞制劑和臨床研究質(zhì)量管理的責任主體，應對干細胞臨床研究項目進行立項審查、登記備案和過程監(jiān)管，并對干細胞制劑制備和臨床研究全過程進行質(zhì)量管理和風險管控，執(zhí)行質(zhì)量管理體系的全面要求。

以同濟大學附屬東方醫(yī)院為例，我院臨床級干細胞庫踐行ISO 9001質(zhì)量管理體系認證，建立了完整的干細胞制劑制備和臨床研究全過程質(zhì)量管理及風險控制程序等質(zhì)量體系文件；實現(xiàn)了干細胞制劑從來源樣本、制備、質(zhì)量檢測、回輸或植入受試者體內(nèi)，到剩余制劑處置等環(huán)節(jié)的可追溯；建立了干細胞臨床研究審核體系，具備完整的干細胞質(zhì)量控制條件；定期對庫存系統(tǒng)進行審核，建立了不合格品讓步放行規(guī)定及糾正與預防措施，從而實現(xiàn)持續(xù)的質(zhì)量改進。

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小結(jié)和展望

為適應我國干細胞庫產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，滿足干細胞大規(guī)模、長期戰(zhàn)略貯存及臨床轉(zhuǎn)化需求，需合理規(guī)劃和建設(shè)臨床級干細胞庫。臨床級干細胞庫從設(shè)計規(guī)劃、基礎(chǔ)建設(shè)到人員、設(shè)備、物料、檢驗方法和環(huán)境管理等方面，只有遵循國內(nèi)外的指南與倫理準則，建立全面的質(zhì)量管理體系，實現(xiàn)干細胞生命周期的數(shù)據(jù)跟蹤與雙向追溯，才能為臨床提供高質(zhì)量的干細胞資源。

目前，我國臨床級干細胞庫的建設(shè)與管理，仍存在規(guī)劃不合理、標準不統(tǒng)一等諸多問題，臨床級干細胞庫資源應用的政策框架、技術(shù)規(guī)范、產(chǎn)品標準、臨床準入、評估指標、轉(zhuǎn)化模式、倫理準則等方面亟需形成行業(yè)共識及標準。

相信隨著對干細胞醫(yī)療的重視以及干細胞關(guān)鍵技術(shù)的不斷成熟，未來干細胞產(chǎn)業(yè)發(fā)展中的相關(guān)問題將會不斷被更新和突破！

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